## 类器官原代培养流程

### 一、准备工作

1. **仪器设备**：CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2. **试剂耗材**（以肠癌为例）：动物脑类器官培养基试剂盒、基质胶（低因子、无酚红）、细胞培养皿、滤筛、离心管、细胞培养板等。

**组分规格**：动物脑类器官培养基A（100mL）、类器官原代培养缓冲液B（250mL）、原代组织消化液C（30mL）、类器官传代消化液D（30mL）、组织保存液E（100mL）、类器官冻存液F（20mL）、类器官传代培养缓冲液G（250mL）。

### 二、操作流程

1. **样本准备**

(1) 将组织放入4°C的组织保存液中，随后在4℃下从医院/实验室取回。

(2) 消毒取样瓶，拍照并记录组织的大小、颜色、软硬程度等信息。

2. **清洗与剪碎**

在细胞培养皿中用原代培养缓冲液B浸泡组织，剪碎至1-3mm³。

3. **消化与过滤**

向离心管中加入消化液，37℃下消化15-30分钟，随时观察消化情况。消化后加入缓冲液终止反应，利用滤筛进行过滤，并进行离心。

4. **加胶、点板与添加培养液**

(1) 准备基质胶并在金属冰盒中融化，移液器和离心管需预冷。

(2) 接种时每孔加入混合物和培养液，接种密度为25:1，以保证细胞生长。

(3) 培养板放入37℃的培养箱内，40-60分钟成胶，再添加培养基。

### 三、类器官传代操作

1. **类器官收集及洗涤**

轻柔吹散基质胶，加入缓冲液，静置以促使基质胶软化后进行离心，弃去上清，保留类器官沉淀。

2. **类器官消化与再培养**

适量添加传代消化液，在超净台内进行消化，确保不消化为单细胞，终止消化并重复离心分离。

3. **加胶、点板与添加培养液**

准备融化基质胶及预冷的移液器，在2-3孔中富集类器官进行再培养，控制操作时间以保持基质胶流动性。

### 四、类器官冻存

选择在类器官指数生长期进行冻存，收集后轻柔加冻存液，进行梯度冻存操作。

### 五、复苏过程

通过准备水浴锅和消毒超净工作台，迅速解冻冻存管内容物，进行重悬和离心分离。

将复苏的类器官与基质胶混合，添加相应的培养基，放置于培养箱中。

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