### 细胞裂解液的制备

尊龙凯时为生物医疗研发提供了一系列优质的细胞裂解液制备方案。细胞裂解液的制备能够有效提取细胞内的蛋白质，以下是详细的步骤与注意事项。

#### 一、试剂准备

1. 新鲜配制的冷RIPA裂解缓冲液：

• 150mM NaCl
• 1% NP-40（去垢剂）
• 0.1% SDS（去垢剂）
• 2 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
• 2 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
• 1 mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
• 15 mM EDTA（蛋白酶抑制剂）
• 1 mM Na Vanadate（磷酸脂酶抑制剂，任选）

以上所有试剂按比例溶于150 mM NaCl溶液中。

2. 冷PBS中添加：1 mM PMSF，15 mM EDTA，1 mM Na Vanadate（钒酸钠，任选）。

3. 对于生长状态良好的细胞，需要至少准备3-4瓶75 cm²的细胞培养基（90%以上的培养面积）。

#### 二、实验步骤

1. 将细胞培养瓶放置于冰上，用吸液管吸出培养液。随后加入足够的冷PBS充分洗涤细胞表面，去除残留的培养基，重复2-3遍。在最后一次洗涤时尽量吸干残留的PBS，并保持在冰上操作。

2. 向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75 cm²培养瓶加入1 ml），用细胞刮刀从瓶壁轻轻刮取细胞。如果有多瓶同样细胞，吸出第一瓶的细胞裂解液并转入下一瓶继续刮取（由于处理后的细胞裂解液粘稠，建议使用直径较大的吸液管）。

3. 吸出处理好的细胞裂解液，放入14 ml离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩余细胞。

4. 尽可能收集尽量多的细胞裂解液到14 ml的离心管中。将样品放入冰盒进行超声处理，超声强度应控制在不产生泡沫为准，每次超声2-3秒，重复3-4次。如有细胞碎片或沉淀，需在10000 rpm下离心10分钟，留取上清液。

5. 取出少量细胞裂解液，测定其蛋白浓度（可用尊龙凯时的生物技术产品进行测定，如Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计，在A280处测定），并将样品分装保存于-70℃。

#### 三、细胞裂解方法

细胞裂解可通过物理或化学方法实现：

1. 物理法：

• 反复冻融：将细胞反复放置于-20℃和25-30℃环境中，进行10至20次的冻融循环，适用于大多数哺乳动物细胞。
• 煮沸法：将细胞置于100℃的沸水中煮5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。
• 超声法：使用超声破碎仪对细胞进行超声处理，适用于绝大多数微生物细胞。
• 渗透压法：将薄膜较弱的细胞（如血细胞）浸入低渗透溶液中，使细胞吸水破裂。
• 液氮法：植物细胞通常采用液氮磨碎的方法进行裂解。

2. 化学法：

• 强酸、强碱溶液：例如使用0.5N NaOH溶液，能裂解绝大部分动物细胞和微生物细胞。
• 生物酶：普遍使用溶菌酶、蛋白酶K等酶进行微生物细胞的裂解。

通过了解以上步骤，您可以有效地制备细胞裂解液，提取所需的细胞成分，以满足生物医学领域的需求。选择尊龙凯时，为您的实验提供更可靠的支持与服务！