操作步骤如下：

1. 细胞准备

在培养板中，将已爬好的细胞玻片用PBS浸洗3次，每次3分钟，以确保细胞表面清洁。

2. 固定细胞

随后，用4%的多聚甲醛固定爬片15分钟，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，确保细胞固定充分。

3. 通透处理

接下来，使用5% Triton X-100（用PBS配置）在室温下通透20分钟（如果细胞膜上表达抗原，可以省略此步骤）。

4. 血清封闭

用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟后，用吸水纸吸干PBS，然后在玻片上滴加正常山羊血清（前提是二抗来源为山羊），并在室温下封闭30分钟。

5. 加入一抗

用吸水纸吸掉封闭液，不再洗涤。每张玻片上滴加足量的稀释一抗，并放入湿盒中，4°C孵育过夜。

6. 加入荧光二抗

用PBST浸洗爬片3次，每次3分钟，吸水纸吸干多余液体后，滴加稀释好的荧光二抗，在湿盒中20-37°C孵育1小时，然后再次用PBST浸洗切片3次，每次3分钟。注意：从加入荧光二抗开始，后续步骤尽量在较暗环境下进行。

7. 再次血清封闭

再次用吸水纸吸干液体，并在玻片上滴加正常山羊血清（前提是二抗来源为山羊），在室温下封闭30分钟。

8. 再次加入一抗

用吸水纸吸去封闭液，不进行洗涤，随后滴加稀释好的另一种一抗，完成后于4°C湿盒中避光孵育过夜（注意：第二种一抗必须与第一种一抗种属不同，例如小鼠和兔子）。

9. 加入荧光二抗

用PBST浸洗爬片3次，每次3分钟。吸水纸吸干多余液体后，滴加稀释好的荧光二抗，在湿盒中20-37°C孵育1小时，最后用PBST浸洗切片3次，每次3分钟。请注意：如果第一种抗体使用红色荧光，第二种抗体必须选择不同颜色的荧光。

10. 复染细胞核

最后，滴加DAPI避光孵育5分钟以对标本进行染核，随后用PBST洗去多余DAPI，洗涤4次。

11. 观察图像

用吸水纸吸干爬片上的液体，使用含有抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。

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